Theravision – Plattformtechnologie zur Entwicklung, Herstellung und Testung von Viren zur Tumortherapie

Viren sind fähig, effizient in Zellen einzudringen, darin eigene Proteine herzustellen, sich zu vermehren und schließlich die von ihnen infizierten Zellen abzutöten. Aufgrund dieser Eigenschaften haben Viren großes Potential in der Krebstherapie. Klinische Studien mit onkolytischen (krebszerstörenden) Viren sind vielversprechend, jedoch besteht erheblicher Optimierungsbedarf hinsichtlich Spezifität und Wirksamkeit der Viren, bei Verfahren zu ihrer Herstellung sowie bei Modellen zur präklinischen Testung. Im Rahmen der MAVO TheraVision wird daher auf Basis eines klinischen Isolates des Herpes Simplex Virus 1 (HSV1) eine breit einsetzbare Plattformtechnologie zur kombinierten onkolytischen Virus-Immuntherapie mit den drei Säulen a) Engineering von therapeutischen Virus-Vektoren, b) Herstellung der Viren mit robusten und skalierbaren Verfahren und c) Testung mittels neuer und aussagefähigerer präklinischer in vitro und in vivo Modelle entwickelt.

Krebs ist eine Krankheit, die viele von uns direkt oder indirekt betrifft. In Deutschland stellt Krebs nach den Herz-Kreislauferkrankungen die zweithäufigste Todesursache dar. Weltweit waren im Jahr 2018 ca. 8 Millionen Menschen Opfer von Krebs, mit zunehmender Tendenz insbesondere durch die wachsende Bevölkerung und die steigende Lebenserwartung.

Über lange Jahre dominierten konventionelle Therapieformen (Chirurgie, Radio- und Chemotherapie) mit mäßigem Erfolg die Behandlung von Krebserkrankungen. Erst im letzten Jahrzehnt konnten alternative und immer stärker personalisierte Therapie-Konzepte erhebliche Fortschritte in der Krebsbehandlung erzielen. Zu den großen Hoffnungsträgern gehören Immuntherapien und onkolytische Viren. Mit Hilfe dieser Therapieansätze sollen Nebenwirkungen, wie sie bei konventionellen Ansätzen auftreten, reduziert, die Anzahl der auf die Therapie ansprechenden Patienten erhöht sowie nachhaltige, langfristige Therapieerfolge erzielt werden.

Obwohl die Fähigkeit von Viren, Krebszellen abzutöten, seit langem bekannt ist, ist ihr therapeutisches Potential erst im letzten Jahrzehnt in den Fokus gerückt. Erste Ergebnisse aus präklinischen und klinischen Studien mit onkolytischen Viren sind vielversprechend. Ein HSV1-basiertes Virus, genannt Imlygic®, erhielt 2015 als erstes onkolytisches Virustherapeutikum die Zulassung von der Food and Drug Administration (FDA) zur Therapie des malignen Melanoms, und wurde in Folge von der European Medicines Agency (EMA) anerkannt. Dieser Durchbruch wirkt stimulierend auf die Entwicklung neuer viraler Therapeutika. Als eine Alternative zur Virustherapie stehen sogenannte Immunmodulatoren insbesondere in Form von Immuncheckpoint-Inhibitoren im Fokus der Forschung und Entwicklung. Aktuell besteht große Hoffnung in der Kombination von immunmodulatorischen Therapien mit alternativen Therapieansätzen. Insbesondere die Kombination aus Virus- und Immuntherapien durch Co-Applikation dieser Therapieformen stellt eine aussichtsreiche Alternative dar und wird derzeit in ersten klinischen Studien untersucht.

Im Rahmen des vorliegenden Projekts wurde ein onkolytisches Plattform-Virus entwickelt. Durch Integration von Transgenen in den Virusvektor ist es gelungen, Immunmodulatoren während der Virusvermehrung in Krebszellen zu exprimieren. Damit sind die Grundlagen für eine kombinierte Virus-Immuntherapie gelegt, bei der beide Therapieformen am Ort der Infektion konzertiert und synergistisch wirken können. Von dieser hochinnovativen Kombinationstherapie wird erwartet, dass sie eine effektive, sichere und nachhaltige Zerstörung von Tumoren sowie Metastasen ermöglicht und gleichzeitig die Gefahr von systemischen Nebenwirkungen minimiert.

Das Ziel der MAVO TheraVision ist die Etablierung einer breit einsetzbaren Plattformtechnologie zur kombinierten onkolytischen Virus-Immuntherapie auf Basis der drei Säulen i) Engineering der nächsten Generation therapeutischer Herpes Simplex Virus 1 (HSV1)-Vektoren, ii) Entwicklung geeigneter Herstellungsverfahren zum Einsatz der Viren als pharmazeutische Wirkstoffe und iii) Testung mittels neuer und aussagefähigerer präklinischer Modelle. Als proof of concept ist ein onkolytisches Virus zur Therapie des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms (Non-Small Cell Lung Cancer; NSCLC), welches mit einer hohen Mortalitätsrate einhergeht, in Entwicklung.

Engineering eines Vektors / Virus

Zur Etablierung eines HSV1-Plattformvirus wurde ein klinisches Isolat mit hoher Potenz und Acyclovir-Sensitivität ausgewählt. Das Genom dieses HSV1-Isolats wurde als bakterielles Riesenchromosom (BAC; bacterial artificial chromosome) in E. coli kloniert, um es damit der einfachen und gezielten Manipulation durch bakterielle Genetik zugänglich zu machen. Aus diesen BACs rekonstitutierte Viren waren in ihren Wachstumseigenschaften dem klinischen Isolat vergleichbar. Zur Integration von Fremdgenen in diesen HSV1-BAC wurden zwei Insertionsstellen im herpesviralen Genom identifiziert. Das Resultat war der sogenannte Plattform-Vektor zur modularen Insertion von Fremdgenen und damit zur vielfältigen Funktionalisierung des Virus. Bei Insertion von Transgenen entstehen potente funktionalisierte Viren, die bei ihrer Vermehrung die kodierten Proteine exprimieren.

Entwicklung eines Herstellungsprozesses

Im Rahmen des MAVO TheraVision wird ein robustes und skalierbares Herstellungsverfahren für therapeutische Viren etabliert, das die nötigen GMP-Anforderungen (Good Manufacturing Practice) für die spätere Herstellung des klinischen Prüfpräparats berücksichtigt. Insbesondere werden hier kritische Prozessparameter im Up- und Downstream Processing, der Einsatz von Rohstoffen, das Verunreinigungsprofil, sowie die Stabilität von Intermediaten und des Produktes selbst adressiert. Die Virusproduktion basiert auf der Bioreaktorkultivierung von adhärenten Vero-Zellen auf sogenannten Microcarriern. Durch eine optimierte Prozessführung, in deren Fokus die abgestimmte Balance aus Zelldichte, Infektionszeitpunkt und Verhältnis infizierender Viren zur Lebendzellzahl steht, ist es gelungen Virustiter von bis zu 6x107 pfu/mL Kulturüberstand zu erreichen. Das Verfahren zeichnet sich durch hohe Robustheit und Skalierbarkeit in den für den klinischen Materialbedarf erforderlichen Maßstab aus. Prozessbegleitende Modellierungen können zudem dabei unterstützen, den Infektionszeitpunkt und den Erntezeitpunkt bezüglich der Zielfunktionen Ertrag, Leistung und Reinheit zu optimieren. Die korrespondierende Aufreinigungssequenz sieht den kombinierten Einsatz aus klassischen und neuartigen Chromatographiematerialien vor. Die Gesamtausbeute des Prozesses erreicht Purified Bulk Mengen, die für klinische Studien der Phasen I und II ausreichend sind.

 

Präklinische Testsysteme für eine kombinierte Virus-Immuntherapie

Zur Testung der Therapieeffekte von Viren mit kombinierter Virus- und Immuntherapie sind neue präklinische Modelle erforderlich, welche möglichst vergleichbar mit der Patientensituation sind. Der proof of concept für die kombinierte onkolytische Virus-Immuntherapie soll am Beispiel des NSCLC erbracht werden.

TP3.1 in vitro 3D Tumormodell

Zur in vivo-nahen Testung werden innerhalb der präklinischen Testplattform des TheraVision-Konsortiums neuartige Tumormodelle auf einer intestinalen Gewebe-Matrix (Small Intestinal Submucosa with mucosa = SISmuc) eingesetzt. Nach etwa zehn Tagen entstehen Modelle mit einer gewebeähnlichen Homöostase. Durch Bioreaktoren kann der Gewebeaufbau verbessert und die Kultur- und Therapiedauer bis zu einigen Wochen verlängert werden. Für das Projekt wird ein Silikon-Bioreaktor entwickelt, der als Einwegreaktor kostengünstig im S2-Bereich einsetzbar ist. Die Wirksamkeit des HSV1 konnte im 3D Lungenkarzinommodell an Zelllinien dosis- und zeitabhängig in einem Therapiezeitraum von drei bis sieben Tagen demonstriert werden. Der Bedarf der im Konsortium angestrebten Optimierung des Virus wird durch eine unvollständige Abtötung der Tumorzellen in tieferen Gewebestrukturen verdeutlicht. Quantifizierungen der Viruswirksamkeit im 3D Modell sind anhand von HE-Färbungen, MTT-Testung und mit Hilfe von Lumineszenz-Detektion nach Luciferase-Transduktion möglich.

TP3.2. Mausmodelle mit Tumorzelllinien

Das neu etablierte Plattform-Virus wird mit Hilfe von immundefizienten Mausmodellen mit biolumineszenten Lungenkarzinom-Zelllinien, welche mit einer hoch-sensitiven Lichtkamera in der Maus nachgewiesen werden können, getestet. Des Weiteren kann durch die Transplantation von humanen hämatopoetischen Stammzellen in diese immundefizienten Mäuse ein teilweise funktionelles humanes Immunsystem generiert werden. Die Kombination aus humanisierten Mäusen mit einem humanen Tumorwachstum bietet die Möglichkeit, auch Effekte, die auf einer Immunaktivierung beruhen, zu untersuchen. Alle drei Testverfahren wurden bereits mit Modellviren etabliert, um nun das funktionalisierte HSV1 für die in vivo Testung des neuen Therapieverfahrens einzusetzen. Diese Plattform-Testverfahren-Technologie kann zukünftig für diverse Tumortherapieansätze eingesetzt werden.

TP3.3 PDX-Mausmodell

Um die Wirksamkeit der Viren direkt an Patientenmaterial zu testen, wurden patient-derived xenograft (PDX) Modelle aus Primärtumoren von NSCLC Patienten generiert. Diese Modelle können dauerhaft kultiviert werden und wurden in Bezug auf die Expression der für die Virustherapie notwendigen Zielmoleküle charakterisiert. Zusätzlich zu den transplantierten PDX Modellen wurden hämatopoetische Stammzellen aus Nabelschnurblutproben in immundefiziente Tiere injiziert, um so zusätzlich ein humanes Immunsystem zu generieren (humanisierte Mäuse). Mittels dieser Modelle kann nun die Wirksamkeit der onkolytischen Viren inklusive immunmodulatorischer Effekte auf Primärtumore und Metastasen in Anwesenheit humaner Immunzellen (insbesondere T-Zellen) direkt an Patientenmaterial analysiert werden. 

 

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