Schnelle Züchtungsergebnisse durch TILLING

Für die Kartoffel wurde eine modifizierte TILLING-Technik entwickelt, die die artspezifischen Besonderheiten (Autotetraploidie, Heterozygotie, vegetative Vermehrung) berücksichtigt. Ziel ist, die TILLING-Technologie für die Kartoffel weiter zu entwickeln und verschiedene Vorgehensweisen unter Abwägung der Vor- und Nachteile für die praktische Kartoffelzüchtung aufzuzeigen.

Es wurden beispielhaft die Erbanlagen für Enzyme aus dem Stärkemetabolismus der Kartoffel ausgewählt, deren Produkte an der Biosynthese der verschiedenen Stärketypen  in Kartoffelknollen beteiligt sind. Es wurden Klone identifiziert, die neue Allele der Zielgene tragen. Diese Klone werden derzeit züchterisch bearbeitet.

Ergeben sich neue Herausforderungen für die Kartoffelzüchtung, denen die Ressourcen der bestehenden Sorten und Zuchtklone nicht genügen, so  kann auf  das genetische Repertoire der sexuell kompatiblen Wildarten zurückgegriffen werden. Diese tragen jedoch neben den gewünschten Genen/Allelen auch Erbgut, das den Ertrag und wichtige Qualitätseigenschaften mindert.

Dieses unerwünschte Erbgut muss dann in einem aufwändigen und ggf.  Dekaden dauernden Pre-breeding entfernt werden. Da dies ein sehr zeit- und kostenintensiver Prozess ist, wurde nach alternativen Wegen zur Bereitstellung neuer Allele für die praktische Kartoffelzüchtung gesucht. In jüngerer Zeit hat sich mit der Technik des TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes) eine weitere Quelle eröffnet, die neue Allele für die Züchtung bereitstellen kann.

Kernelement der für die Kartoffel modifizierten TILLING-Methode ist das Durchmustern einer Mutantenpopulation diploider Kartoffeln nach induzierten Mutationen mittels Sanger-Sequenzierung der Zielgene. Verschiedene Allele eines Gens können sich durch Insertions/Deletionspolymorphismen unterscheiden, die insbesondere in den Intronbereichen auftreten.

Zum eindeutigen Nachweis etwaiger Mutationen im Zielgen heterozygoter Organismen müssen die Allele des Zielgens aus beiden Kreuzungspartnern gleiche InDel-Muster tragen. Andernfalls verschieben sich die Sequenzen gegeneinander und sind nicht mehr analysierbar. In diploiden Kartoffeln lassen sich über Sequenzierung die EMS-generierten Allele leicht detektieren, da die neuen single nucleotide polymorphisms (SNPs) und die  Ursprungssequenz im Verhältnis 1:1 vorliegen. Aus diesem Grund muss die Samenproduktion für die EMS Mutagenese auf Basis diploider Eltern erfolgen, die außerdem sexuell kompatibel sein müssen. Dies ist bei diploiden Kartoffeln nicht selbstverständlich, da sie ein System der gametophytischen Selbstinkompatibilität ausprägen.

Je nach Züchtungsziel werden die Kreuzungspartner aus den Segmenten Frischware, Veredelung, Flocken oder Stärke eines diploiden Elite-Zuchtprogrammes ausgewählt. Somit werden die neuen Allele direkt in den gewünschten genetischen Hintergrund eingeführt, ein für die praktische Kartoffelzüchtung wichtiger, da zeitsparender Aspekt.

Das aus diesen Kreuzungen resultierende Saatgut wird mit EMS behandelt und dient dann dem Aufbau einer einige tausend Kartoffelklone umfassenden Population, die durch vegetative Vermehrung erhalten wird. Die Sequenzierung der jeweiligen Zielgene der einzelnen EMS-Klone erfolgt im Hochdurchsatzverfahren, um anschließend identifizierte Zuchtklone mit neuen Allelen in die Gewebekultur aufzunehmen. Hier werden die Genome mit geeigneten Methoden verdoppelt, um tetraploide Pflanzen zu generieren, die dann direkten Eingang in die praktische Kartoffelzüchtung finden.

Die Arbeit mit TILLING-Populationen aus diploiden Kartoffeln hat sich in der Praxis bewährt, es wurden inzwischen verschiedene Targetgene aus dem Stärkemetabolismus der Kartoffel bearbeitet und die verschiedensten »missense« und »nonsense« Mutationen induziert und identifiziert, welche nun Eingang in die praktische Kartoffelzüchtung gefunden haben. Zum Beispiel wurde in Zusammenarbeit mit einem Kartoffelzuchtbetrieb eine »nonsense" Mutation, welche ein Splice-Site im Gen für die Stärkekorn gebundene Stärke Synthase 1 (GBSS 1) betrifft, identifiziert.

Im Zuge eines verhältnismäßig kurzen Züchtungszyklus konnten hiermit homozygote amylosefreie Stärkekartoffeln gezüchtet werden, ein Merkmal welches eine deutliche Wertsteigerung darstellt, da so eine optimale Nutzung der resultierenden Stärke emöglicht wird, ohne die bei herkömmlicher Stärke für verschiedene Nutzungen (z.B. Papier- , Textil- und Klebstoffherstellung) erforderliche Entfernung oder Modifikation der Amylose. Trotz der positiven Erfahrungen mit der TILLING Methode mit diploiden Kartoffeln, wurde eine Technik zur Herstellung tetraploider TILLING Populationen entwickelt. Diese lassen sich im Gegensatz zu diploiden Populationen dauerhaft in Form von Samen lagern.

Die stetige Erstellung neuer TILLING Populationen entfällt so, außerdem können identifizierte Mutanten ohne aufwändige Gewebekulturschritte, direkten Eingang in die Sortenzüchtung finden. Das Screening derartiger Populationen ist zur Zeit noch schwierig, in naher Zukunft wird aber das »Next Generation Sequencing« routinemäßig und preiswert zum Screening von TILLING-Populationen eingesetzt werden und die bislang benutzten Techniken ersetzen. Dabei sind dann auch keine Nachteile beim Screening einer tetraploiden Kartoffel TILLING-Population mehr zu erwarten.

Bioplant, Biotechnologisches Forschungslabor GmbH
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